Désamidation de l’asparagine et de la glutamine

La désamidation est une dégradation discrète : elle ne change la masse d’un peptide que de 1 dalton. Elle peut pourtant modifier sa charge, sa structure et son activité. Elle concerne les résidus asparagine (Asn, N) et, plus lentement, glutamine (Gln, Q).

Le mécanisme

Pour l’asparagine, la réaction passe par un intermédiaire cyclique :

1. l’azote de la liaison peptidique suivante attaque la chaîne latérale amide de l’Asn ;
2. une molécule d’ammoniac est libérée ; il se forme un succinimide (cycle à cinq atomes, −17 Da) ;
3. le succinimide s’hydrolyse en aspartate (Asp) ou en isoaspartate (isoAsp), en général dans un rapport d’environ 1:3.

Bilan : Asn → Asp ou isoAsp, +0,98 Da. L’isoaspartate insère un carbone supplémentaire dans le squelette ; ce n’est plus le même peptide.

La glutamine désamide par un mécanisme analogue mais beaucoup plus lent (cycle à six atomes). En position N-terminale, elle se cyclise plutôt en pyroglutamate (−17 Da).

Les séquences à risque

La vitesse dépend surtout du résidu qui suit l’asparagine, car c’est son azote qui attaque :

Séquence	Vitesse relative
Asn-Gly	Très rapide (demi-vie de l’ordre du jour à pH 7,4 et 37 °C)
Asn-Ser, Asn-His, Asn-Ala	Rapide
Asn suivie d’un résidu encombré	Lente
Asn-Pro	Quasi nulle

L’aspartate suivi d’une glycine (Asp-Gly) forme le même succinimide par déshydratation (aspartimide, −18 Da) et s’isomérise aussi en isoAsp.

Les facteurs qui l’accélèrent

• pH neutre à basique : la vitesse augmente nettement au-dessus de pH 7.
• Température : chaque dizaine de degrés multiplie la vitesse.
• Tampons : phosphate et bicarbonate catalysent la réaction.
• Flexibilité : une région structurée protège ; une région désordonnée expose.

Sous forme lyophilisée, sans eau mobile, la désamidation est négligeable. Elle est donc d’abord un problème de solutions conservées.

La détecter

• Spectrométrie de masse : +0,98 Da. Pour un peptide de 3 000 Da, il faut une bonne résolution pour séparer ce massif isotopique de celui du produit (voir Spectrométrie de masse).
• HPLC : les formes Asp et isoAsp sont un peu plus acides, et sortent souvent en épaulement ou juste avant le pic principal.
• Charge : la désamidation ajoute une charge négative, visible en électrophorèse capillaire ou en échange d’ions.

Les peptides du catalogue concernés

Peptide	Résidu sensible	Contexte
Thymosine α1	Asn28 C-terminale	Exposée, sans résidu suivant
Thymuline	Gln5, Asn9	Gln-Gly en position 5–6
Kisspeptine-10	Asn2, Asn4	Asn-Trp, Asn-Ser
VIP	Asn9, Asn24, Asn28	Plusieurs sites
LL-37	Asn30, Gln22	Peptide long et flexible

La limiter

1. Conserver le peptide lyophilisé jusqu’à l’usage.
2. Préparer les solutions à pH légèrement acide (5–6) quand l’essai le permet.
3. Éviter les tampons phosphate pour le stockage des solutions mères.
4. Aliquoter et congeler (voir Aliquotage).

La désamidation fait partie des produits de dégradation présentés dans Impuretés peptidiques.