Spectrométrie de masse : confirmer l’identité d’un peptide

La pureté HPLC dit combien de l’échantillon est un seul composé. La spectrométrie de masse (MS) dit lequel. Sans elle, un rapport d’analyse ne prouve rien sur l’identité du peptide. Voici comment elle fonctionne et comment lire la ligne « Identité : conforme » d’un certificat.

Du peptide à l’ion

Un spectromètre de masse mesure le rapport masse sur charge (m/z) d’ions en phase gazeuse. Pour les peptides, la source la plus courante est l’électronébulisation (ESI) : la solution sortant de la colonne HPLC est pulvérisée sous haute tension, les gouttelettes s’évaporent et libèrent des ions protonés.

Un peptide porte souvent plusieurs protons, un par site basique accessible (N-terminal, lysine, arginine, histidine). On observe donc une série d’ions multichargés :

m/z = (M + n × 1,007) ÷ n

Pour le BPC-157, de masse monoisotopique 1 418,7 Da, on attend [M+H]⁺ à 1 419,7 et [M+2H]²⁺ à 710,4. Pour un peptide long comme la thymosine β4 (≈ 4 963 Da), les ions observés portent 4 à 8 charges ; un logiciel de déconvolution reconstitue la masse neutre.

Masse monoisotopique ou moyenne ?

• Masse monoisotopique : calculée avec l’isotope le plus abondant de chaque élément (¹²C, ¹H, ¹⁴N, ¹⁶O, ³²S). C’est la masse du premier pic du massif isotopique, utilisée pour les petits peptides en haute résolution.
• Masse moyenne : pondérée par l’abondance naturelle des isotopes. C’est celle des fiches techniques (« masse molaire »), et celle que donne la déconvolution des grosses molécules.

L’écart entre les deux grandit avec la taille : environ 0,9 Da pour 1 400 Da, près de 3 Da pour 5 000 Da. Un rapport doit préciser laquelle il compare.

Que signifie « conforme » ?

L’analyste compare la masse mesurée à la masse théorique de la séquence annoncée. L’écart toléré dépend de l’instrument : quelques ppm en haute résolution (Orbitrap, TOF), ±0,5 Da en quadripôle simple. « Conforme » signifie que l’écart est dans la tolérance et que le spectre ne montre pas d’espèce majoritaire inattendue.

Ce que la MS révèle au-delà de l’identité

Les écarts de masse ont une signification chimique. Les plus fréquents :

Écart	Cause probable
+16 Da	Oxydation (méthionine sulfoxyde, voir oxydation)
+1 Da	Désamidation d’une Asn ou d’une Gln (voir désamidation)
−18 Da	Perte d’eau, cyclisation (pyroglutamate, succinimide)
+42 Da	Acétylation (attendue ou non)
+22 / +38 Da	Adduits sodium / potassium, artefacts de source
−(masse d’un résidu)	Délétion pendant la synthèse

C’est ce tableau qui permet, par exemple, de distinguer le TB-500, heptapeptide acétylé de 889 Da, de la thymosine β4 complète : la différence de masse est sans ambiguïté.

Limites

La MS ne distingue pas deux isomères de même masse : une L-alanine d’une D-alanine, ou deux séquences permutées. Elle quantifie mal, car tous les peptides ne s’ionisent pas avec la même efficacité. C’est pourquoi elle complète l’HPLC sans la remplacer (voir HPLC en phase inverse). Pour lever le doute sur une séquence, on recourt à la fragmentation (MS/MS), qui lit la chaîne résidu par résidu.

Sur nos rapports

Chaque rapport de lot publié dans notre bibliothèque associe la pureté HPLC et l’identité par MS, avec le numéro du rapport et la clé de vérification du laboratoire. La méthode de vérification est décrite dans Lire un certificat d’analyse.