Aliquotage et cycles congélation-décongélation

Une solution de peptide supporte mal d’être congelée puis décongelée à répétition. La parade est connue de tous les laboratoires : l’aliquotage. Encore faut-il le faire au bon moment et avec le bon matériel.

Ce qui se passe pendant une congélation

Quand une solution gèle, l’eau cristallise en premier. Le peptide, les sels et le tampon se concentrent dans les poches de liquide restantes : c’est la cryoconcentration. Dans ces poches :

• la concentration en peptide peut être multipliée, favorisant l’agrégation ;
• le pH peut varier fortement, notamment avec les tampons phosphate dont un sel précipite avant l’autre ;
• les interfaces glace-liquide dénaturent les peptides structurés.

À la décongélation, le phénomène se répète en sens inverse. Chaque cycle ajoute sa part d’agrégats et de produits de dégradation, invisibles à l’œil nu au début.

La règle : un aliquot = un usage

Dès la préparation de la solution mère (voir Mettre en solution un peptide lyophilisé) :

1. Calculer le volume nécessaire à une expérience, plus une petite marge.
2. Répartir toute la solution en aliquots de ce volume.
3. Congeler immédiatement les aliquots, à plat dans une boîte.
4. Ne décongeler qu’un aliquot à la fois, et jeter le reste après usage.

Choisir les tubes

Contenant	Pour	Attention
Microtubes en polypropylène à faible adsorption	Volumes de 20 à 500 µL	Indispensables pour les peptides hydrophobes et les faibles concentrations
Cryotubes à bouchon vissé et joint	Stockage à −80 °C, azote liquide	Étiquettes résistantes au froid
Flacons stériles sertis	Volumes plus importants, stérilité	Ponction à travers le septum
Verre non traité	À éviter pour les peptides basiques	Adsorption sur la silice chargée

Les peptides hydrophobes ou amphiphiles (lipopeptides, LL-37) s’adsorbent sur les parois : à faible concentration, on peut perdre une part significative du peptide sur un tube standard.

Congeler et décongeler correctement

• Congeler vite : un aliquot de petit volume gèle rapidement, ce qui limite la cryoconcentration. Certains laboratoires plongent les tubes dans l’azote liquide ou la carboglace avant de les transférer au congélateur.
• Décongeler vite aussi, mais sans chauffer : quelques minutes à température ambiante ou dans la main, puis homogénéiser doucement (retournement, pas de vortex prolongé).
• Centrifuger brièvement pour ramener le liquide au fond du tube.
• Ne jamais recongeler un aliquot entamé.

−20 °C ou −80 °C pour les aliquots ?

Pour quelques semaines, −20 °C suffit pour la plupart des peptides courts et stables comme le Selank ou le DSIP. Pour plusieurs mois, ou pour les peptides sensibles à l’oxydation comme le MOTS-c, −80 °C est préférable. Le détail est dans −20 °C ou −80 °C : choisir la température de stockage.

Tenir un registre

Chaque boîte d’aliquots mérite une fiche : peptide, lot, concentration, solvant, date, nombre d’aliquots, et une case cochée à chaque sortie. On sait ainsi combien il en reste et depuis quand ils sont congelés. C’est aussi ce qui permet de relier un résultat inattendu à un lot précis (voir Numéro de lot et traçabilité).

Et la poudre ?

La poudre lyophilisée n’a pas besoin d’être aliquotée : elle supporte mieux les variations de température que la solution. Les règles qui la concernent sont rassemblées dans Conserver des peptides lyophilisés.