Ponts disulfure : chimie et analyse des peptides à cystéines

La cystéine est le seul acide aminé standard qui porte un thiol (–SH). Deux cystéines peuvent s’oxyder pour former une liaison covalente S–S, le pont disulfure. Ce pont fige la structure d’un peptide, change sa masse et complique son analyse. Voici l’essentiel.

La réaction

2 R–SH → R–S–S–R + 2 H⁺ + 2 e⁻

Le pont se forme par oxydation douce (oxygène de l’air, DMSO, iode, ferricyanure) et se rompt par réduction (dithiothréitol DTT, TCEP, β-mercaptoéthanol). Chaque pont formé retire deux hydrogènes : la masse baisse de 2,0 Da.

Intramoléculaire ou intermoléculaire

• Intramoléculaire : les deux cystéines appartiennent à la même chaîne. Le peptide devient cyclique. C’est le cas de l’AOD-9604, dont les Cys7 et Cys14 sont reliées : sa formule C78H123N23O23S2 (1 815,1 g/mol) tient compte de ce pont.
• Intermoléculaire : deux chaînes sont reliées, formant un dimère de masse 2M − 2. C’est la forme oxydée du glutathion (GSSG), à partir de deux molécules de glutathion réduit (GSH).

Un peptide à une seule cystéine libre, comme l’humanine (Cys8), peut donc se dimériser spontanément en solution au contact de l’air.

Effet sur la masse

Forme	Masse
Peptide réduit (2 Cys–SH)	M
Pont intramoléculaire	M − 2
Dimère par pont intermoléculaire	2M − 2
Cystéine oxydée en acide cystéique	M + 48 (par Cys)

En spectrométrie de masse, l’écart de 2 Da entre formes réduite et oxydée est faible pour un peptide de 1 800 Da : il faut une résolution suffisante pour séparer les massifs isotopiques (voir Spectrométrie de masse).

Effet en HPLC

La forme cyclique (pont intramoléculaire) est plus compacte et sort généralement avant la forme réduite linéaire. Un dimère sort nettement plus tard. Un lot qui montre deux pics proches de même masse à 2 Da près contient un mélange de formes oxydée et réduite.

Le test classique : traiter un aliquot au DTT, puis réinjecter. Si les deux pics se réunissent en un seul, ce sont bien les deux états redox du même peptide.

Conserver un peptide à cystéines

Objectif	Mesure
Garder les thiols libres	Solution dégazée, pH < 7, agent réducteur (TCEP) si compatible
Préserver un pont existant	Éviter les réducteurs, pH neutre à légèrement acide
Éviter les dimères	Faible concentration, aliquots congelés, flacon sous argon
Éviter la suroxydation	Pas d’oxydants forts, protection contre la lumière

À pH basique, les thiols se déprotonent en thiolates, beaucoup plus réactifs : les échanges de ponts et la dimérisation s’accélèrent. C’est pourquoi on évite de conserver ces peptides dans des tampons au-dessus de pH 8.

Plusieurs ponts : la question de l’appariement

Avec quatre cystéines ou plus, plusieurs appariements sont possibles et donnent des isomères de même masse. La synthèse utilise alors des protections orthogonales pour former chaque pont dans l’ordre voulu. Aucun peptide du catalogue n’en compte plus d’un.

Pour aller plus loin

L’oxydation des cystéines au-delà du pont, ainsi que celle de la méthionine et du tryptophane, est traitée dans Oxydation de la méthionine, de la cystéine et du tryptophane. Le calcul de formule avec ponts est détaillé dans Calculer la formule brute et la masse molaire.