Détection UV à 214 et 280 nm : choisir la longueur d’onde

L’absorbance UV est la mesure la plus utilisée sur les peptides : c’est elle qui produit le chromatogramme HPLC, et c’est elle qui permet de vérifier la concentration d’une solution. Encore faut-il choisir la bonne longueur d’onde. Deux dominent : 214 nm et 280 nm.

214 nm : la liaison peptidique

Entre 190 et 230 nm, c’est la liaison amide elle-même qui absorbe. Tous les peptides sont donc visibles à 214 nm, qu’ils contiennent ou non des résidus aromatiques. C’est la longueur d’onde standard des analyses de pureté :

• elle détecte les impuretés quelle que soit leur composition (une délétion sans aromatique reste visible) ;
• elle est très sensible ;
• mais elle voit aussi de nombreux solvants et additifs (TFA, acide formique, tampons), ce qui impose des solvants de qualité HPLC.

280 nm : les résidus aromatiques

À 280 nm, seuls absorbent notablement :

Résidu	ε à 280 nm (M⁻¹·cm⁻¹)
Tryptophane (Trp, W)	≈ 5 500
Tyrosine (Tyr, Y)	≈ 1 490
Pont disulfure (cystine)	≈ 125
Phénylalanine (Phe, F)	négligeable à 280 nm

Un peptide sans Trp ni Tyr, comme le BPC-157 ou le KPV, est pratiquement invisible à 280 nm.

Quantifier une solution par absorbance

Pour un peptide qui contient Trp ou Tyr, la loi de Beer-Lambert donne la concentration sans dépendre de la pesée :

A = ε × l × c

avec ε = 5 500 × nW + 1 490 × nY + 125 × nC–C, l = 1 cm (cuve standard), c en mol/L.

Exemple : décapeptide-12 (YRSRKYSSWY) : 3 Tyr et 1 Trp. ε = 3 × 1 490 + 5 500 = 9 970 M⁻¹·cm⁻¹. Une absorbance de 0,50 correspond à 50 µM, soit 0,070 mg/mL avec une masse molaire de 1 395,5 g/mol.

Exemple : dipeptide-2 (Val-Trp) : ε = 5 500. A = 0,55 ↔ 100 µM.

Exemple : kisspeptine-10 (YNWNSFGLRF-NH2) : 1 Tyr, 1 Trp, ε = 6 990.

Cette mesure contourne les incertitudes de teneur nette : elle donne la quantité réelle de peptide en solution, contre-ions et eau exclus.

Bonnes pratiques de mesure

1. Cuves en quartz : le plastique et le verre ordinaire absorbent sous 300 nm.
2. Blanc avec le même solvant : l’alcool benzylique de l’eau bactériostatique absorbe vers 257 nm et fausse la mesure ; préférez l’eau stérile pour une solution à quantifier.
3. Absorbance entre 0,1 et 1,0 : en dehors, diluer ou concentrer.
4. Corriger la diffusion : une solution légèrement trouble absorbe partout ; mesurer aussi à 320–340 nm, où le peptide n’absorbe pas, et soustraire.

Et en HPLC ?

Les détecteurs à barrette de diodes enregistrent tout le spectre. Comparer les chromatogrammes à 214 et 280 nm aide à identifier les pics : une impureté visible à 214 nm mais pas à 280 nm a perdu son résidu aromatique, ou n’en a jamais eu. Pour la lecture d’un chromatogramme, voir HPLC en phase inverse.

Les peptides du catalogue quantifiables à 280 nm

Décapeptide-12, dipeptide-2, Thymogen, Pancragen, kisspeptine-10, MOTS-c, DSIP, VIP, PE-22-28, entre autres : leur séquence, sur la fiche, indique immédiatement s’ils contiennent W ou Y.

Le calcul des concentrations est développé dans Calculer la concentration d’une solution mère.